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Obra de Andreu Julià en estilo gótico florido (1356-1369), la actual capilla del Santo Cáliz se destinaba en un principio a la celebración de reuniones del capítulo de la catedral, es decir, a sala capitular. También se usaba para enterramiento de prelados y canónigos, y en su subsuelo hay una cripta que hoy se encuentra cegada. Después sirvió de cátedra de teología, siendo también aprovechada para reunirse las Cortes Valencianas. Más tarde recibió el nombre de Capilla del Cristo de la Buena Muerte, pero el 1916 se decidió el traslado del Santo Cáliz a la capilla, de donde proviene su actual nombre.

Originalmente era una capilla exenta, pero en 1496 Pere Comte concluyó el pasillo, en estilo gótico florido, que la unía con el resto de la catedral. Para acceder, hay que entrar por la puerta de los Hierros y girar a mano derecha hasta que encontramos una entrada al pasillo o sala de acceso, al final de la cual hay una portalada gótica en piedra que permite el ingreso en la capilla. En este pasillo de acceso encontramos cinco sepulcros góticos de piedra, uno de los cuales del obispo Vidal de Blanes, que mandó edificar la Sala Capitular, hoy del Santo Cáliz. Además encontramos un cristo tallado en madera, bajo el que hay un fresco pasado a lienzo de la Adoración de los Pastores, obra de 1472, de Paolo de San Leocadio. Esta obra, que se encuentra en un estado de conservación pésimo, era uno de los frescos que realizó para mostrar su maestría y acreditarse para pintar el presbiterio y es, al mismo tiempo, una de las primeras pinturas renacentistas –si no la primera- hecha en la Península Ibérica. Ante este fresco hay un retablo de San Miguel posterior, de principios del XVI, obra temprana del Maestro de Gabarda, todavía de estructura gótica, aunque de transición al Renacimiento. Resulta interesante compararlo tanto con la Adoración de los Pastores de Paolo de San Leocadio como con el cuadro del Bautismo del Cristo, obra de madurez del mismo Macip.

La Capilla del Santo Cáliz, de planta cuadrada, mide trece metros de lado y dieciséis de altura, con paredes lisas de piedra oscura labrada y tres ventanales con vidriedras polícromas. Destaca la bella y complicada bóveda gótica con ocho nervaduras y veinticuatro arcos terceletes que forman una estrella de ocho puntas, que descansan sobre ménsulas policromadas. Sobre las claves de la bóveda, también polícromas, figuran los doce apóstoles, salvo en la central, donde hay la coronación de la Virgen en el cielo después de la asunción.

También hay que resaltar el retablo, tallado en alabastro, que enmarca el Santo Cáliz, que procede de la antigua fachada gótica del trascoro, y que fue colocado aquí en 1777, al ser sustituido áquel por otro neoclásico, hoy desaparecido. Es obra de los arquitectos Antoni Dalmau y Julià lo Florentí (1441-1446), y además intervinieron los escultores Joan de Sagrera, Joan de Sogorb y Arnau de Bruselas. En la parte superior del retablo destacan los doce relieves de Julià lo Florentí, que son una de las primeras obras del Renacimiento en España. Las escenas inferiores corresponden al Antiguo Testamento, mientras que las superiores corresponden al Nuevo.

El tesoro más importante que alberga esta sala, del que recibe el nombre, es el Santo Cáliz, donado por el rey Alfonso el Magnánimo el 1437 y conservado en la sala de reliquias hasta que en 1916 se trasladó en esta capilla. Hasta 1744 el cáliz era empleado con regularidad, pero le cayó a un religioso en el suelo y se agrietó; después dejó de usarse y quedó como simple objeto de culto. Actualmente se encuentra protegido por un farol y descansa sobre una ménsula dentro del retablo gótico de alabastro antes mencionado. La copa es de piedra de tipo ágata oriental o calcedonia, de la variedad llamada cornalina, de color rojo oscuro. Su diámetro es aproximadamente de diez centímetros y su altura de siete. Tanto la superficie exterior como la interior son lisas. La baza es pequeña, de forma circular. Está fechada en el siglo I d. C.

El pie de la copa está constituido por una navecilla, en posición invertida, también de calcedonia muy translúcida, ribeteada en oro. La unión entre el pie y la copa y las dos asas están finamente trabajadas en oro. La montura, de fina orfebrería, está encastada con valiosas perlas y esmeraldas. Tanto el pie como las asas fueron montadas en tiempo medievales.

La leyenda de esta reliquia menciona que, a la muerte de la Virgen María, los discípulos de Jesús se repartieron todo lo que guardaba y que San Pedro se llevó el cáliz a Roma. A causa de las frecuentes persecuciones sufridas por los cristianos, el papa Sixto II entregó la preciada reliquia a San Lorenzo mártir, su diácono, el cual hizo trasladar el cáliz a Huesca, su patria. Allí estuvo el Santo Cáliz hasta el año 712, en que los cristianos, huyendo de los musulmanes, se refugiaron en los Pirineos y finalmente en el monasterio de San Juan de la Peña, cerca de Jaca.

De allí, según citan los historiadores, pasó a Zaragoza, al palacio real del Aljaferia. El Santo Cáliz fue donado por la comunidad de San Juan de la Peña al rey de Corona de Aragón, Martín el Humano en 1399, el cual, agradecido, entregó a cambio a los monjes de San Juan otro cáliz de oro.

El Santo Cáliz estuvo en poder de los monarcas de la Corona de Aragón hasta que en 1437 Alfonso el Magnánimo, que había llevado a Valencia la reliquia para la capilla de su palacio real, debiendo ausentarse del Reino de Valencia, las entregó a la catedral, que desde entonces alberga el Santo Cáliz.

La histórica capilla presenta también unos bancos de piedra, que circundan el recinto, que sirvieron para asiento en la antigua aula de estudios. Y, en el muro de la derecha, se encuentra el púlpito gótico de piedra desde el cual San Vicente Ferrer explicaba su cátedra de teología, mientras a su derecha se encuentra el cuadro la Adoración de los Reyes de Julià lo Florentí (1469-1472), pintado al fresco, restaurado y pasado en lienzo.

En el muro, a mayor altura, se encuentran colgantes dos grandes trozos -de cincuenta-nueve y de setenta metros, respectivamente- de grandes cadenas. Son las que antaño cerraban el puerto de Marsella, que tenía fama de inexpugnable, y que el 19 de noviembre de 1423 rompió la nave de Romeu de Corbera, que comandaba el ataque de Alfonso el Magnánimo a la capital de la Casa de Anjou, rival del rey. Las cadenas del puerto fueran tomadas como trofeo, llevadas a Valencia y donadas por el propio rey a la catedral.

En la misma acción también fueran presas como botín de guerra las reliquias de San Luis de Tolosa, patrón de Marsella, que fueron igualmente donadas a la catedral (si bien devueltas a Francia por Fernando VI de España). En un primer momento, las cadenas fueron depositadas en el presbiterio pero con las reformas del año 1779 pasaron a la actual capilla del Santo Cáliz.

También hay un cuadro de Vicente López Portaña, del siglo XIX, que representa la expulsión de los moriscos, y una pintura del siglo XV que representa a San Cristóbal.

Frente al muro donde se encuentra el púlpito hay una puerta gótica que conduce al interesante Museo de la Catedral, donde hay obras de pintores primitivos valencianos, como Jacomart y Rodrigo de Osona, y otros autores, como Juan de Juanes, Castellanu, Correggio, Orrente, Espinosa, Vicente López Portaña, Camarón, y Francisco de Goya.